Основу для донской породы составили лошади степного типа, которых на протяжении длительного времени улучшали жеребцами восточных, а затем чистокровной верховой и некоторых других заводских пород. Восточные (турецкие, персидские, карабахские, туркменские) производители попадали к казакам в качестве военных трофеев во время Турецких войн.
Первым, кто попытался разобраться в происхождении донской лошади, был А.Ф. Грушецкий (Генерал-майор, Член совета Главного управления Госуд. коннозаводства). В статье "Задонская лошадь", опубликованной в "Альбоме Всероссийской конской выставки в Москве в 1910" он писал: "Коренное кочующее население степи - остатки гунов, их одноплеменники киргизы и калмыки. Волга разделила пополам два родственных племени киргизов и калмыков, разделила их на магометан и буддистов, также разделила их породу рогатого скота, овец и лошадей, имеющих один коренной источник. Родоначальницей нашей восточной степной лошади является лошадь монгольская со славным ее историческим прошлым. На ней совершался стремительный натиск монголов. На ней полчища татар наложили иго на княжества русских князей. Эта лошадь, пришедшая из глубин восточных степей, впоследствии разделилась на две породы с некоторыми морфологическими отличиями. По левую сторону Волги - малорослая киргизская лошадь с густым волосяным покровом и более грубыми формами. По правую - калмыцкая, она, находясь в более мягких климатических условиях, рослее, нежнее и несколько благородна".
Словарь Брокгауза и Ефрона дает следующее описание старого, еще не сильно отдалившегося от степных предков типа донской лошади XIX века: "Казачья лошадь характеризуется горбатой головой, тонкой и длинной шеей, прямой и сильной спиной, глубокой подпругой, длинными и сухими ногами и вообще тощим складом тела и небольшим ростом (редко выше 2 арш. 2 в.); масть преимущественно бурая, караковая и рыжая, реже серая или гнедая. Она отличается неутомимостью, выносливостью и неприхотливостью к условиям содержания, остротой зрения и дальнозоркостью, дикостью нрава и быстротой хода (6 вер. в 9 мин. и 13 вер. — в 18 мин.)". Однако эта лошадь испытывала постоянное улучшающее влияние восточной крови. В XVIII - начале XIX веке особенно много поступало на Дон в качестве военных трофеев персидских и карабахских лошадей. По окончании русско-персидских войн эти поступления прекратились, но снабжение донского коневодства улучшателями взяло на себя государственное управление коннозаводством; оно организовывало закупочные экспедиции, которые в основном приводили туркменских лошадей. В 1839 году на Дону использовалось около 800 туркменских (ахалтекинских и иомудских) производителей.
В XIX веке очень сильно было влияние карабахской крови. Значительная часть конного завода карабахских ханов, проданного наследниками, попала на Дон.
В середине XIX века для улучшения задонского коневодства государство организовывало закупочные экспедиции за восточными, в основном туркменскими лошадьми. Именно восточная, и прежде всего карабахская кровь придала донской лошади отличающее ее своеобразие экстерьера и золотисто-рыжую масть. В конце XIX века Задонье стало одним из важнейших районов ремонтного коневодства. Для кавалерии нужна была более крупная и сильная лошадь, и все большее влияние стало приобретать скрещивание с чистокровной верховой породой. Использовались на Дону и некоторые орлово-ростопчинские и стрелецкие жеребцы